补肾活血中药“杜仲-当归”
治疗骨性关节炎的作用及制研究
孙亮亮1钮俊杰4鲁琛2
应建伟3叶承锋3通讯作者
(1医院,杭州,;2医院,杭州,;2医院,杭州,;4医院骨科,苏州,)
骨性关节炎(Osteoarthtitis,简称OA)是一种以关节软骨的退行性病变和继发性骨质增生的慢性关节疾病,是骨科常见病?多发病,其患病率随着年龄增大而增加,据世界卫生组织统计,50岁以上的人群中OA的发病率为50%,75岁以上的人群中发病率为80%,给病人及家庭带来较大痛苦和负担,严重影响病人的生活质量?目前OA的临床诊断存在着局限性,尚无有效的OA早期诊断手段,往往病人就诊时已发展为中?晚期,严重影响其正常工作及生活?OA的治疗方法主要包括药物治疗和手术治疗,药物主要是镇痛消肿及改善功能,常用的消炎镇痛药公认存在消化性溃疡?心血管危害等问题;外科手术治疗主要是对晚期OA患者施行关节置换术,但手术伴有并发症,风险较大,成本高,病人经济压力大?因此,目前对OA的治疗缺乏切实有效的治疗手段和治疗药物?我国目前已进入老龄化社会,OA的发病率逐年递增,研究OA的发病机制和有效防治OA的药物是当前迫切需要解决且具有重大意义的课题?
几千年的传承和发展,中医药逐渐被世界所认可,突显其无可替代的优势?本研究明确补肾活血中药的作用,探寻补肾活血中药对OA的调控机制?中医认为骨性关节炎属于“骨痹”范畴,是肾虚血瘀?本虚标实?虚实夹杂之证,《内经?素问》曰“肾主骨,生髓”?“肾,其充在骨”,《内经》有云:“肝主筋?肾主骨”《中藏经》中说:“骨痹者,乃嗜欲不节,伤于肾也?”因此,人到中年以后,肾虚较为明显,肾虚导致生理性衰退,筋骨不荣,关节软骨及软骨下骨得不到濡养,而引起关节软骨的退变,最终导致本病的发生,故肾虚是发病的根本?肾虚日久,气血渐虚,血运无力,脉络空虚,筋骨失养,加之邪气侵袭,流注于骨,经脉受阻,久之导致血行不畅,脉络瘀阻而至血瘀,发而为痹?清.王清任《医林改错》中亦有“瘀血致痹”之说,故可见血瘀是发生本病的关键因素?因此,中医认为肾虚是OA发病的根本,气血瘀滞是发病的关键,属“本虚标实”,故以补肝肾?强筋骨?补益气血以治其本,祛风散寒胜湿?活血通络止痛以治其标,临床多采用补肾活血中药?根据大量的文献检索及临床用药,并结合课题组前期对补肾活血方的研究,补肾中药如熟地?杜仲?骨碎补?山茱萸?黄芪?活血中药如当归?川芎?丹参?独活?威灵仙?桃仁等,常用于防治OA的临床和动物实验研究?
1实验材料1.1实验动物
SPF级雄性SD大鼠,体重-g?由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供,动物生产许可证号SCXK(沪)-?
饲养条件:恒温,温度22±2℃,湿度50%-60%,光照每12小时明暗交替,换风次数15-20次/小时?由浙江中医药大学动物实验研究中心饲养?实验饲养室许可证号SYXK(浙)-?
1.2实验仪器及试剂
实验仪器:脱水机(武汉俊杰电子有限公司,JJ-12J);包埋机(武汉俊杰电子有限公司,JB-P5);病理切片机(上海徕卡仪器有限公司,RM);倒置荧光显微镜(日本尼康NIKON,ECLIPSETI-SR);成像系统(日本尼康NIKON,DS-U3);生化培养箱(上海齐欣,LRH-);酶标仪(Thermo,ScientificCMaxPlus);全自动脱水机(LeicaA,SPS);石蜡切片机(LeicaRM);电子天平(上海花潮,UTP-);正置荧光显微镜(Leica,DM0)?
无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司);二甲苯(国药集团化学试剂有限公司,);RatIL-1βELISA检测试剂盒(艾莱萨生物科技(上海)有限公司,);RatTNF-αELISA检测试剂盒(艾莱萨生物科技(上海)有限公司,);RatMMP13ELISA检测试剂盒(艾莱萨生物科技(上海)有限公司,);PBS磷酸盐缓冲液(pH7.2-7.4)(MDL,MD);HRPpolymerconjugate(Invitrogen公司,A);MMP13(Abcam,)?
2实验方法2.1实验动物分组
将SD大鼠按随机数字表分成6组,共计45只
A:空白对照组(6只)
B:OA模型组(9只)
C:补肾组(杜仲)(6只)
D:活血组(当归)(6只)
E:补肾活血组(杜仲-当归)(10只)
F:阳性药物组(西乐葆?奥泰灵联合给药)(8只)
各组动物每日分别给予相应的药物,一日一次,连续8周,给药组分别给予相同浓度的杜仲?当归?杜仲-当归药液,药液浓度2g生药/mL,剂量2mL/g;阳性药物组给予西乐葆和奥泰灵混合液,药液中奥泰灵浓度0.05g/mL?西乐葆浓度0.g/mL,剂量2mL/g,OA模型组和空白对照组给予等量的生理盐水?
2.2模型大鼠的制备
SD大鼠在无菌条件下,10%水合氯醛腹腔注射(0.3ml/g)麻醉,麻醉后大鼠仰卧位固定于操作台,剃须刀剃除双侧膝关节周围绒毛,用酒精棉球擦拭2遍,术者微屈大鼠膝关节以微量注射器由髌骨内侧下方斜上刺入关节腔,左膝关节腔注射碘乙酸盐50μl建立OA模型组,右膝关节腔注射等量无菌生理盐水作为对照,正常对照组的大鼠双侧膝关节内注射50μl无菌生理盐水?注射后各组大鼠置于标准动物饲养笼中自由活动及进食,膝关节不予固定?
2.3HE染色?SO染色标本制备
心脏采血完成后,采用脱颈法处死各组大鼠,截取膝关节,剔除皮肤和肌肉?将其放置于10%多聚甲醇中浸泡24小时,后用清水反复冲洗2小时,再放置于10%EDTA中脱钙4-5周,在脱钙过程中,将标本置于37℃恒温下,每天均匀摇晃标本,重复3次,每次大致10分钟,每周更换一次脱钙液?脱钙至标本基本软化,当使用切片刀切割标本没有阻力感时,则说明组织已经脱钙完全?再用流水反复冲洗标本2-3小时,将冲洗干净的膝关节标本放置于自动脱水机中脱水,梯度脱水的流程为:70%乙醇2小时?80%乙醇1小时?90%乙醇2小时?95%乙醇2小时?无水乙醇第一缸2小时?无水乙醇第二缸2小时?无水乙醇第3缸2小时,二甲苯第一缸40分钟?二甲苯第二缸40分钟?石蜡第一缸2小时?石蜡第二缸2小时?将脱水完毕的标本浸蜡6h,包埋机包埋,后将蜡块放入自动切片机内切片,切片厚度4μm,贴附于载玻片上?60℃烤片,冷却备用?分别进行常规HE染色和SO染色,光镜下观察各组大鼠膝关节软骨的层次?软骨细胞及软骨下骨的变化?
2.4HE染色观察OA大鼠膝关节软骨的层次?软骨细胞及软骨下骨的变化
1)切片常规用二甲苯脱蜡,经各级乙醇至蒸馏水洗:二甲苯(I)5min→二甲苯(II)5min
2)无水乙醇2min→95%的乙醇1min→80%乙醇lmin→75%乙醇lmin→蒸馏水洗2min
3)苏木素染色5min,自来水冲洗5min
4)盐酸乙醇分化30s
5)自来水浸泡15min
6)置伊红液2min,自来水冲洗
7)常规脱水,透明,封片:95%乙醇(I)1min→95%乙醇(II)3min→无水乙醇(I)5min→无水乙醇(II)5min→二甲苯(I)透明5min→二甲苯(II)透明5min→中性树脂封固
8)图像采集和分析:通过显微镜拍照,采集分析样本相关部位?
2.5SO染色观察OA大鼠膝关节软骨的层次?软骨细胞及软骨下骨的变化
1)二甲苯进行脱蜡10-15min,2次
2)无水乙醇?95%乙醇?90%乙醇?85%乙醇脱水各1-2min,然后蒸馏水冲洗1-2min;
3)苏木素染液7min;
4)自来水缓慢漂洗10min;
5)盐酸乙醇(盐酸1ml,70%乙醇99ml)分化,显微镜下控制,水洗1min
6)稀氨水(1%)5s,水洗1min;
7)固绿染液3min;
8)1%醋酸快速漂洗10-15s;
9)藏红染液5min,蒸馏水漂洗
10)常规脱水,依次85%乙醇脱水20s,90%乙醇脱水30s,95%乙醇2次,每次1-2min,无水乙醇2次,每次约2-3min;
中性胶封固,倍光镜下观察?
2.6ELISA检测(可参照试剂盒说明书)
1)准备:从冰箱取出试剂盒,室温复温平衡20min?
2)配液:用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液?
3)加标准品和待测样本:取足够数量的酶标包被板,固定于框架上,分别设置
标准品孔?待测样本孔和空白对照孔,记录各孔位置,在标准品孔中加入标准品50μL;待测样本孔中先加入待测样本10μL,再加样本稀释液40μL(即样本稀释5倍);空白对照孔不加?
4)除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体μL?
5)温育:用封版膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min?
6)洗板:弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机按说明书操作洗板)?
7)显色:每孔先加入显色剂A液50μL,再加入显色剂B液50μL,平板混匀器混匀30s(或用手轻轻震荡混匀30s),37℃避光显色15min?
8)终止:取出酶标板,每孔加终止液50μL,终止反应?
9)测定:以空白孔调零,在终止后15min内,用nm波长测量各孔的吸光值(OD值)?
2.7免疫组化标本制备
心脏采血完成后,采用脱颈法处死各组大鼠,截取膝关节,剔除皮肤和肌肉?将其放置于10%多聚甲醇中浸泡24小时,后用清水反复冲洗2小时,再放置于10%EDTA中脱钙4-5周,在脱钙过程中,将标本置于37℃恒温下,每天均匀摇晃标本,重复3次,每次大致10分钟,每周更换一次脱钙液?脱钙至标本基本软化,当使用切片刀切割标本没有阻力感时,则说明组织已经脱钙完全?再用流水反复冲洗标本2-3小时,将冲洗干净的膝关节标本放置于自动脱水机中脱水,梯度脱水的流程为:70%乙醇2小时?80%乙醇1小时?90%乙醇2小时?95%乙醇2小时?无水乙醇第一缸2小时?无水乙醇第二缸2小时?无水乙醇第3缸2小时,二甲苯第一缸40分钟?二甲苯第二缸40分钟?石蜡第一缸2小时?石蜡第二缸2小时?将脱水完毕的标本浸蜡6h,包埋机包埋,后将蜡块放入自动切片机内切片,切片厚度4μm,贴附于载玻片上?60℃烤片,冷却备用?光镜下观察各组大鼠膝关节软骨的层次?软骨细胞及软骨下骨的变化?
2.8免疫组化观察OA大鼠膝关节MMP13的表达
给药4周后,解剖大鼠,每组随机取3只大鼠膝关节,放入10%中性甲醛中固定24h后,取材包埋,将膝关节脱钙后,再用石蜡包埋切片?
石蜡切片经60℃烘片1小时,经二甲苯脱蜡(二甲苯I10min,二甲苯II10min)?梯度酒精(%3min,%3min,95%3min,90%3min,85%3min,75%3min,蒸馏水3min,蒸馏水3min,PBS3min)?
抗原修复:将切片置于0.1mol/L且PH=6.0的枸橼酸液修复液中,用微波炉火力三分钟至微微沸腾,再用50火力维持7分钟,停止加热后自然冷却20-30分钟?用PBS漂洗5min×3/次?
免疫杂交:3%H2O2孵育10分钟以消除内源性过氧化物酶活性?PBS冲洗,5分钟×3次?滴加封闭液(5%BSA),在湿盒中室温30分钟?用滤纸擦去封闭液,勿洗?滴加适宜浓度的MMP13一抗(1:)置湿盒中4℃孵育过夜,再用PBS5分钟×3次洗去一抗,用滤纸擦去标本外的PBS?滴加生物素化二抗工作液,室温置湿盒中孵育20分钟,用PBS5分钟×3次洗去二抗,用滤纸擦去标本外的PBS?滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液,室温置湿盒中孵育20分钟,用PBS5分钟×3次洗去,用滤纸擦去标本外的PBS?DAB显色剂显色,自来水充分冲洗?再进行苏木素复染,脱水,透明,中性树胶封片?切片在10×40倍显微镜下随机选取大鼠膝关节不重复6个视野?
2.9统计学处理
采用SPSS19.0统计软件进行数据分析,所有数据以均值±标准差(`x±s)表示,不同组间两两比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA)中的LSD法(最小显著性法),P0.05为差异有统计学意义?
3结果与分析3.1HE染色和SO染色观察补肾活血中药对OA大鼠膝关节软骨的影响
从图1和图2可知,正常对照组大鼠膝关节软骨细胞形态正常,排列紧密,软骨层厚度适宜,无软骨脱失现象,骨小梁结构与形态紧密正常?模型对照组大鼠膝关节面破坏严重,甚至出现大面积脱落,关节软骨坏死,半月板广泛脱失,软骨下骨硬化,骨小梁稀疏碎裂,结构素乱;相比于模型对照组,各给药组的大鼠膝关节病理学表现均有显著改善,关节面较为光滑平整,关节软骨细胞形态尚可,排列较为紧密,无坏死溃瘍,骨小梁结构与形态较为完整,初步可判断病变程度从高到低依次为模型组?活血组?补肾组?活血补肾组?阳性药物组?
3.2ELISA检测大鼠血清和关节滑膜组织IL-1β﹑TNF-α和MMP13的表达情况
从表1和图3可以得知,OA模型组与正常组比较,血清中炎症因子IL-1β含量明显上升(P0.01)?杜仲+当归组(补肾活血组)?阳性组和正常组血清中IL-1β含量基本在同一水平,且低于OA模型组(P0.01)?同时杜仲+当归组(补肾活血组)血清中IL-1β的含量要低于单独用药的当归组和杜仲组?
从表3和图4可以得知,OA模型组与正常组比较,血清中的TNF-α含量明显上升(P0.01)?杜仲+当归组(补肾活血组)?阳性组和正常组血清中TNF-α含量基本处于同一水平,且低于OA模型组(P0.01)?同时杜仲+当归组(补肾活血组)血清中TNF-α含量要略低于单独用药的当归组和杜仲组?
从表1和图5可以得知,OA模型组与正常组比较,血清中MMP13含量明显上升(P0.01)?杜仲+当归组(补肾活血组)和阳性组血清中MMP13含量基本处于同一水平,且低于OA模型组(P0.01)?同时杜仲+当归组(补肾活血组)血清中MMP13含量要略低于单独用药的当归组和杜仲组?
从表1和图6可以得知,OA模型组与正常组比较,膝关节滑膜中MMP13含量明显上升(P0.01)?杜仲+当归组(补肾活血组)和阳性组膝关节滑膜中MMP13含量基本处于同一水平,且低于OA模型组(P0.05)?同时杜仲+当归组(补肾活血组)膝关节滑膜中MMP13含量要略低于单独用药的当归组和杜仲组?
3.3免疫组化观察补肾活血中药对OA大鼠膝关节MMP13表达的影响
从表2?图7和图8的免疫组化结果表明,正常组大鼠膝关节未见MMP13阳性表达?模型组大鼠具有明显的MMP13阳性染色且阳性染色面积和累积光密度值显著升高(P0.01)?相对于模型组,补肾组?活血组?补肾活血组和阳性药物组大鼠MMP13阳性表达?阳性染色面积和累积光密度值均明显降低,降低程度从高到低依次为阳性药物组?补肾活血组?补肾组?活血组?
4讨论骨性关节炎的发病一般与衰老?创伤?肥胖?代谢障碍和遗传等因素有关,其发病机制较为复杂,目前尚不明确,主要有基质金属蛋白酶(MMPs)降解学说?自由基学说?细胞因子学说?一氧化氮学说等,但较为主流的是基质金属蛋白酶降解学说?基质金属蛋白酶是水解细胞外基质的各种胶原酶和弹性蛋白酶等?关节软骨细胞外基质主要成分是Ⅱ型胶原,其次是蛋白聚糖,研究认为,胶原酶类能直接降解Ⅰ?Ⅱ?Ⅲ型胶原,且对蛋白聚糖有高度的裂解活性?在OA的病理过程中,关节滑膜细胞及软骨细胞分泌过量的基质金属蛋白酶,打破了金属蛋白酶及其抑制剂平衡,在力学负荷和炎性因子作用下,关节软骨抗应力的能力降低,软骨细胞发生凋亡,细胞外基质成分游离出软骨,最终软骨被破坏?MMP13是作用于软骨降解中的主要酶,它不仅作用于II型胶原降解,同时也作用于软骨中蛋白聚糖?IV?IX型胶原?骨粘连蛋白及基底膜蛋白聚糖的降解?临床研究证明,关节软骨被破坏的患者MMP13高水平表达,说明增高的MMP13可能与软骨退变相关?实验研究还表明MMP13过表达转基因小鼠可发生自发性关节软骨破坏的表型?
由上所述,若能有效抑制MMP13的过表达就有可能对软骨起到修复作用,达到逆转OA表型的效果,因此MMP13抑制剂很可能是预防和治疗骨性关节炎的潜在药物?在过去的30年中,多于50种MMP13抑制剂作为治疗关节炎?癌症?心血管疾病的候选药物被研究,然而,由于存在诸多潜在的副作用和毒性作用,如:脂肪代谢紊乱?皮质激素轴功能紊乱导致?血糖血压升高?溃疡?消化道出血等,这些MMP13抑制剂未能作为药物应用于临床,至今尚未有一种MMP13抑制剂获得审批?因此,寻找安全有效?具有抑制MMP13表达水平的中药显得尤为重要?
补肾活血中药治疗OA的疗效?干预OA病程的发展在长期临床实践中得到了充分的肯定,但因其作用机制不明确大大影响了补肾活血中药防治OA的应用?近年来补肾活血中药防治OA的研究日益深入,宁显明等实验研究发现补肾中药对膝骨关节炎软骨的修复明显强于芬必得组?梁祖建等实验研究发现补肾活血方有很好的软骨保护效应,能够延缓OA的进展?实验研究表明补肾活血中药具有促进骨性关节炎软骨细胞增殖的作用并可抑制骨性关节炎软骨细胞中MMP13的过度表达?
本研究通过建立OA模型,以补肾活血中药为代表,进行对MMP13表达的调控研究?首先通过OA模型分别灌胃给予补肾药?活血药和补肾活血药,观察各组中药干预后MMP13的回调及回调程度,并结合组织病理学实验结果,明确补肾活血中药的作用?分别通过采用HE染色和SO染色观察OA大鼠膝关节软骨的层次?软骨细胞及软骨下骨的变化;ELISA检测大鼠血清和关节滑膜组织IL-1β﹑TNF-α和MMP13的表达情况;免疫组化观察补肾活血中药对OA大鼠膝关节MMP13表达的影响?结果显示HE和SO染色初步可判断病变程度从高到低依次为模型组?活血组?补肾组?活血补肾组?阳性药物组;ELISA检测显示:OA模型组与正常组比较,血清中炎症因子IL-1β﹑TNF-α?MMP13含量明显上升(P0.01),与模型组比较,各给药组显著降低IL-1β﹑TNF-α含量,且杜仲+当归组(补肾活血组)血清中的IL-1β﹑TNF-α?MMP13含量要低于单独用药组;免疫组化结果显示:正常组大鼠膝关节未见MMP13阳性表达?OA鼠具有明显的MMP13阳性染色且阳性染色面积和累积光密度值显著升高(P0.01)?相对于模型组,补肾组?活血组?补肾活血组和阳性药物组大鼠MMP13阳性表达?阳性染色面积和累积光密度值均明显降低,降低程度从高到低依次为阳性药物组?补肾活血组?补肾组?活血组?由上述结果可知补肾活血中药(杜仲+当归)对OA具有明确治疗作用,且补肾活血联合组优于补肾组?活血组,揭示补肾活血治则意义,其治疗主要机制可能是通过降低关节软骨中MMP13含量以及血清中的IL-1β和TNF-α含量?
⊙本文来源于《中华中医药学刊》网络首发日期：-08-15。全杜仲（quanduzhong)编校发布。编辑：款冬。内容仅供学习参考，如有侵犯版权请告知，我们将及时删除。往期精彩回顾近30年杜仲研究概况杜仲古今医药价值研究及探讨不同产地杜仲生长特性及叶中主要有效成分含量的差异与动态变化点击阅读原文，